Technologies

Séquençage de nouvelle generation

Le développement de technologies de nouvelle génération a révolutionné le séquençage en termes de séquences produites, de coûts et de compétences à déployer en bioinformatique.

La nouvelle génération de séquenceurs haut débit génère une quantité importante de données avec un seul run. Ils sont utilisés pour de nombreuses applications biologiques, et dans certains cas, remplacent les microarrays. La limitation de l’utilisation de cette technologie ne concerne donc pas la génération des séquences, mais le stockage et l’analyse des données.

Les technologies NGS (Next-Generation Sequencing) sont basées sur des molécules d'ADN fixées sur support solide, des réactions de séquençage cycliques et la détection des séquences par imagerie. Le process peut être résumé de la manière suivante :

  • Préparation des échantillons (amplification, ajout d’adaptateurs) pour créer une librairie ;
  • Fixation de l’échantillon sur une lame de verre et production des clusters ;
  • Réactions cycliques de séquençage avec émission de fluorescence pour chaque type de nucléotide ;
  • Identification de la base (base calling) ;
  • Filtration de données, analyse et interprétation.

Plusieurs échantillons peuvent être séquencés en même temps, avec une grande profondeur de lecture. Des millions de reads sont produits pour chaque échantillon ; chaque base est séquencée plusieurs fois (10X, 20X ...).

Les applications sont nombreuses : identification de variations, de réarrangements génomiques, étude de profils d'expression, séquençage de génome entier, capture de régions cibles pour du re-séquençage ou analyse de la méthylation de l'ADN.

Next Generation Sequencing schema

DNA microarray

Les microarrays expression ont prouvé leur utilité dans de nombreux domaines de la biologie. Ils fournissent des informations de haut-débit aux biologistes et permettent d’avoir une vue globale de la transcription cellulaire : cette technologie mesure l’expression de dizaines de milliers de gènes simultanément pour comparer les niveaux relatifs dans différentes conditions expérimentales. Il est ainsi possible d’identifier des gènes différentiellement exprimés ou co-régulés ou des voies métaboliques d’intérêt.

Les oligonucléotides sont synthétisés sur une surface solide. Ces sondes sont spécifiques des gènes qu’ils ciblent et s’hybrident avec des échantillons marqués. Durant l’acquisition des images, l’émission de la fluorescence est détectée et quantifiée. Les différences d’intensité reflètent les variations d’expression.

Cette technologie est illustrée ci-dessous avec un exemple d’identification d’un génome bactérien :

DNA microarray Schema

Génomique comparative

Le microarray CGH est une technique de cytogénétique moléculaire qui combine la technologie microarray avec une approche CGH : les chromosomes en métaphase sont remplacés par des oligonucléotides afin d’obtenir une meilleure résolution. Cette technique permet donc un mapping précis sur les régions avec aberration. Elle est devenue un outil essentiel à la détection des variations du nombre de copies chromosomiques. Avec un microarray CGH, il est possible de détecter des anomalies déséquilibrées.

Par exemple, avec cette technologie, le génome d’un patient peut être comparé à un génome de référence pour identifier les différences (amplifications et délétions).

Les microarrays custom peuvent être dessinés pour cibler des régions d’intérêt (gènes, chromosomes) pour tout type d’espèces.

CGH Schema

Microarray génotypage

Un microarray génotypage est utilisé pour détecter les polymorphismes d’un génome. Les principes sont les mêmes que pour un microarray expression : une étape d’hybridation, une technologie basée sur la fluorescence, une surface solide, des oligonucléotides et un système pour interpréter les signaux.

Les puces de haute densité pour le génotypage permettent de tester un grand nombre de polymorphismes. Les applications possibles sont des analyses de liaison de génome complet, l’identification d’anomalies à but pronostic en cancérologie ou des études à finalité diagnostiques.

SNP array schema

Quantitative PCR

La PCR en temps réel est basée sur la capacité à suivre en temps réel le process de PCR, en utilisant la fluorescence. Différentes technologies ont été mises au point pour la détection :

  • Des sondes fluorescentes se fixent sur l’ADN double brin ;
  • Des sondes spécifiques sont marquées avec un reporter fluorescent. Dans ce cas, l’intensité est directement proportionnelle aux molécules cibles amplifiées (technologie Taqman®).

Les données sont collectées à chaque cycle et représentent le nombre de produits amplifiés à cette étape. Durant les premiers cycles, l’intensité est très faible et permet de définir la ligne de base. L’accumulation des produits de PCR provoque un changement d’intensité mesurable. Quand la fluorescence dépasse le seuil (phase exponentielle), la valeur Ct (cycle seuil) est définie : cette valeur est utilisée pour quantifier les molécules.

La technique RT-qPCR apporte deux types de réponses :

  • La quantification absolue : elle donne le nombre exact de cibles en comparant les normes avec une courbe d’étalonnage ;
  • La quantification relative : cette méthode est basée sur des gènes de référence (gènes de « ménage ») afin de déterminer les différences de ratio. Cette méthode est plus facile à appliquer car elle ne nécessite pas de courbe d’étalonnage.

qPCR schema